Наверх
ПРОТИВОПАРАЗИТАРНЫЕ ПРЕПАРАТЫ
  • все
  • ПРОТИВОПАРАЗИТАРНЫЕ ПРЕПАРАТЫ
  • АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ ПРЕПАРАТЫ
  • БИОБЕЗОПАСНОСТЬ
  • ДРУГОЕ
Скачать

Птицеводство

Обнаружение сальмонелл в организме красных куриных клещей с помощью полимеразной цепной реакции с применением пластинок FTA®

C. ВАЛИЕНТЕ МОРО, С. ДЕСЛОИРЕ, C . ШОВ и Л . ЗЕННЕР

UMR 958 ENVL/INRA

Простейшие паразиты у домашней птицы,

Национальная школа ветеринарии Лиона, Марси-л' Этуаль, Франция

Для корреспонденции: Sophie Desloire, UMR 958 ENVL/INRA Protozoaires Entericoles et Parasites des Volailles, Ecole Nationale Veterinaire de Lyon, 1 Avenue Bourgelat, 69280 Marcy l ’Etoile, France. Тел.: + 33 4 78 87 25 75; факс: + 33 4 78 87 25 77; электронная почта: s.desloire@vet-lyon.fr

Резюме

Сальмонеллез является наиболее распространенным зоонозом в мире. Поскольку в последнее время появились сообщения о том, что в экспериментальных условиях клещи Дерманиссидовые (Dermanyssus gallinae) являются переносчиком Salmonella Enteritidis (DeGeer), то представилось очень важным, оценить распространенность этих бактерий в популяции клещей.

Описаны молекулярные методики с использованием специфической 16S рДНК Salmonella sp., сочетающие простое выделение ДНК с применением фильтров с ПЦР. Предел определения этим методом составлял 2 х 10 4 бактерий у одного клеща. Чтобы адаптировать эту методику к масштабным исследованиям, было протестировано два сообщества клещей разной численности и проведено предварительное исследование на клещах, собранных с 16 ферм, инфицированных Salmonella Enteritidis в настоящий момент или в прошлом. Клещи, собранные на одной ферме каждого типа, дали положительный результат в исследовании на сальмонеллы, что позволяет предполагать, что куриный клещ (Dermanyssus) может являться резервуаром инфекции при ее передаче от одного стада к другому. В дальнейших исследованиях необходимо провести масштабное изучение роли D. gallinae в эпидемиологии сальмонеллеза кур.

Ключевые слова:

Dermanyssus gallinae, Salmonella, выделение ДНК с применением фильтров, определение с помощью ПЦР.

Введение

Продукция птицеводческих хозяйств является основным источником сальмонелл, которые по пищевой цепи могут быть переданы человеку (Lacey, 1993). Эти бактерии, существуя в организме курицы и не всегда, при этом, нанося ей вред, вызывают наиболее распространенные зоонозы по всему миру. Salmonella Enteritidis является сероваром рода Salmonella, наиболее часто выявляемым у человека. Многие законодательные акты и гигиенические нормативы, касающиеся пищевых продуктов, направлены на профилактику передачи Salmonella Enteritidis.

В дикой природе эти бактерии существуют в различных резервуарах, в том числе, они были обнаружены и у членистоногих (Davies & Breslin, 2003). Куриный клещ (Dermanyssus gallinae) - широко распространенный кровососущий эктопаразит кур-несушек, вызывающий снижение яйценоскости и анемию, приносящий значительный экономический ущерб хозяйствам (Chauve, 1998). Кроме того, этого паразита считают переносчиком некоторых основных патогенных бактерий, включая сальмонелл. Salmonella gallinarum была выделена у клещей, собранных на инфицированных птицефермах (Zeman et al., 1982; Valiente Moro et al. , 2005).

Недавно было продемонстрировано в экспериментальных условиях, что клещ является переносчиком сальмонелл: клещи заражались S. Enteritidis при контакте с кожей инфицированной птицы или при кровососании. Бактерии рода Salmonella размножались в организме клеща, передавались следующему поколению, а также передавались трансстадиально от протонимфы к дейтонимфе. Наконец, было продемонстрировано, что D. gallinae может передавать бактерии при укусе или попадании в желудочно-кишечный тракт птицы (Valiente Moro et al. , 2007a, 2007b).

Для подтверждения роли D. gallinae как естественного переносчика сальмонелл и/или резервуара инфекции на птицефермах необходимо выявить бактерии у клещей, собранных в инфицированных хозяйствах.

Целью настоящего исследования была разработка метода определения Salmonella sp. у клещей и проверка этого метода в предварительных исследованиях на клещах, собранных на инфицированных птицефермах.

Материалы и методы

Определение чувствительности метода

Клещи были собраны у кур-несушек на птицеводческих фермах в регионе Рона-Альпы (Франция). Отсутствие сальмонелл у клещей было ранее подтверждено у трех групп по 15 особей с помощью посева на избирательную среду для сальмонелл (SMID, Biomerieux, Крапон, Франция).

Для оценки чувствительности метода, культивируемые Salmonella enterica, ssp. Enterica, серотип Enteritidis (S. Enteritidis) были введены одному неинфицированному клещу. Культура S. Enteritidis была разбавлена до 1 стандарта МакФарланда (3 х 10 8 КОЕ/мл), а затем были сделаны 10-кратные серийные разведения в забуференной пептонной воде (Biomerieux) до получения от 1 х 108 дo 1 х 102 КОЕ/мл. Из каждого разведения были приготовлены 4 аликвоты по 20 мкл, и к двум из них добавили одного D. Gallinae, после чего, растолкли стерильным пластиковым пестиком. Затем было отобрано 4 образца для ДНК-скрининга, методика которого описана ниже. Четыре наиболее концентрированных разведения культуры были использованы в качестве контроля путем поддерживания их на селективной (избирательной) среде для сальмонелл. Каждый эксперимент повторяли три раза.

Определение сальмонелл у искусственно инфицированных взрослых особей D. gallinae и установление ограничений по пулу (количеству) клещей

Для искусственного кормления и инфицирования клещей использовали специальное устройство для кормления (Bruneau et al. , 2001). Клещей кормили кровью, инфицированной S. Enteritidis, в количестве 108 КОЕ/мл в течение 4-5 ч при 25° C и относительной влажности 60 – 70% в полной темноте. На следующий день после кормления клещей собирали, затем измельчали в 20 мкл забуференной пептонной воды. Из полученного гомогената выделяли ДНК.

Для определения наиболее подходящего размера пула (численности клеща) для анализа, одного инфицированного клеща искусственно измельчали вместе с неинфицированными, а полученный гомогенат тестировали с помощью ПЦР на наличие S. Enteritidis. В целом 22 инфицированных клеща были измельчены по отдельности в 20 мкл забуференной пептонной воды. Из пяти микролитров каждого гомогената выделяли ДНК, которую тестировали с помощью ПЦР на наличие ДНК S. Enteritidis. Оставшиеся 15 мкл каждого гомогената были разбавлены забуференной пептонной водой до 40 мкл. Для 10 пулов 14 накормленных, но неинфицированных клещей измельчали в этих 40 мкл; для 12 пулов брали 29 клещей. Наконец, 10 мкл этого гомогената были обработаны, как описано ниже, в целях выделения ДНК, которую тестировали с помощью ПЦР.

Выделение ДНК с помощью матриц FTA ® и определение сальмонелл молекулярными методами

Образцы ДНК для ПЦР были подготовлены с использованием технологии FTA ® по методике, описанной производителем (Whatman, Брентфорд, Великобритания), с использованием протокола, рекомендованного для образцов крови. Гомогенаты, полученные из одного клеща или пула клещей, были оставлены на 30 минут и 2 часа соответственно, для осаждения дебриса, после чего было отобрано 5 мкл и 10 мкл соответственно, которые нанесли на матрицу FTA ®. Из матрицы, путем перфорирования, получали диски диаметром 1,2 мм (примерно десятая часть общей площади нанесения гомогената), которые промывали, как это описано в протоколе, и использовали, непосредственно как образцы для проведения ПЦР.

Пара праймеров для гена 16S рДНК каждого известного серовара Salmonella enterica sp., кроме подгрупп VI и VII, и S. bongori spp., была использована для амплификации продукта 574 bp (Lin & Tsen, 1996; Ziemer & Steadham, 2003). Каждые 25 мкл реакционной среды ПЦР содержали 0,5 мкл каждого олигонуклеотидного праймера (5 ′ -TGTTGTGGTTAATAACCGCA-3 ′ и 5 ′-CACAAATCCATCTCTGGA-3 ′), 200 мкл каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата (Amersham BioScience,Chalfont St. Giles, Великобритания), 1 ммоль MgCl 2 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США, 2,5 мкл 10X буфера (Invitrogen), 1 ЕД рекомбинантной ТАГ-полимеразы (Invitrogen) и 2 мкл выделенной ДНК, или диск из фильтровальной бумаги FTA ®. В каждый эксперимент с ПЦР включали позитивный и негативный контроль соответственно, ДНК коллонии S. Enteritidis, выделенную с помощью набора для выделения ДНК Qiamp (Qiagen, Куртабеф, Франция), и диск в случае, если наносили только забуференную пептонную воду. Условия термоциклера (MWG Biotech, Эберсберг, Германия) были следующими: 10 минут денатурации при 95° C, затем 37 циклов денатурации 94° C (1 мин), отжиг при сниженной температуре (45 с, 65 − 58° C в течение первых 12 циклов и 58° C в оставшихся 25 циклах), элонгация при 72° C (1 мин) и финальная элонгация в течение 5 минут при 72° C. Электрофорез продуктов амплификации проводили в 2% агарозном геле в 1-кратном трис -ацетат/ этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА).

Изучение клещей, собранных на инфицированных сальмонеллами птицефермах

Наличие сальмонелл определяли в пробах клещей с двух типов ферм с курами-несушками: по заключению Европейской санитарной службы (Direction des Services Veterinaires, DSV) шесть ферм были инфицированы сальмонеллами в момент исследования, а 10 были инфицированы сальмонеллами ранее. На каждой ферме было отобрано от 6 до 20 пулов клещей по 15 особей каждый (всего 249 пулов), которые были протестированы на наличие S. Enteritidis описанным выше методом. Предварительно клещей промывали в 100 мкл 4% параформальдегида в течение 7 минут при постоянном встряхивании и один раз в 100 мкл стерильной воды, следуя ранее описанному протоколу (Valiente Moro et al., 2007a).

Результаты и обсуждение

Поскольку было продемонстрировано, что в экспериментальных условиях D. gallinae является переносчиком S. Enteritidis, то в целях изучения роли клещей в распространении сальмонеллеза на птицефермах, встала необходимость разработать быстрый и простой метод определения наличия сальмонелл в клещах. По этой причине была использована ПЦР, специфичность и чувствительность которой при определении сальмонелл была продемонстрирована (Kwang et al., 1996; Baumler et al., 1997), в комплексе с технологией FTA ®, простым и требующим меньших временных затрат способом выделения ДНК. Эта методика выделения с использованием бумажных фильтров была успешно использована для определения бактерий в пище, таких как сальмонеллы (Lampel et al., 2000), и патогенных бактерий у членистоногих (Higgins et al., 2000; Snowden et al., 2002).

При использовании дисков с нанесенными серийными разведениями в качестве образцов, амплификация отмечалась при разведении 50 КОЕ (Рис. 1А). Этот уровень чувствительности соответствовал таковому при определении Salmonella enterica серотипа Typhimurium при помощи технологии FTA® (Lampel e t al., 2000). Когда в культуру S. Enteritidis вносили в клеща, порог обнаружения составлял 5х102 КОЕ

Поскольку площадь диска, использовавшегося для амплификации, составляла десятую часть общей площади нанесения гомогената и содержала четверть общего количества гомогената, нанесенного на фильтр, то с помощью этого метода можно было определить патоген при содержании его в организме клеща в количестве 2х104. Десятикратное повышение чувствительности можно объяснить присутствием потенциальных ингибиторов ПЦР в тканях клеща и остатках пищи от последнего кормления, как было показано ранее (Desloire et al., 2006).

В исследовании, описывающем определение ДНК Borrelia burgdorferi у накормленных кровью клещей, Schwartz et al. (1997) продемонстрировали наличие у них ингибиторов ПЦР. Однако Peter et al. (1995) получили лучшие результаты по чувствительности, определив 200 риккетсий Cowdria ruminantium у клеща при амплификации участка рСS20 последовательности у C. ruminantium, однако авторы установили этот предел определения, добавляя чистый образец ДНК, выделенной из клеща, к культуре бактерий, а не самого клеща целиком.

ДНК Salmonella Enteritidis была амплифицирована у 43 клещей из 70 (61%), искусственно накормленных инфицированной кровью. Другие клещи, вероятно, содержали бактерии в количестве, меньшем, чем предел определения в 2х104 КОЕ. В созданных нами условиях каждый клещ может проглотить 2х104 КОЕ бактерий во время кровососания (0,2 мкл инокулята с содержанием бактерий 108 КОЕ/мл). На практике существует множество индивидуальных особенностей процесса кровососания, которыми можно объяснить тот факт, что не все клещи по результатам ПЦР имели положительный результат на наличие бактерий (Valiente Moro et al., 2007a). В целях улучшения мониторинга наличия сальмонелл у D. Gallinae, поражающих кур-несушек, были протестированы пулы клещей, с количеством особей 15 и 30, соответственно. В пулах клещей по 30 особей не было получено положительного результата ПЦР, а вот в пулах по 15 особей в 7 из 10-ти пулов был получен положительный результат, хотя каждый из 22 инфицированных клещей ранее демонстрировал положительный результат по ПЦР (Рис. 2). В последующих исследованиях этот метод применялся к пулам численностью 15 особей.

С использованием этой методики были проведены предварительные полевые исследования. Из шести инфицированных в настоящий момент птицеферм только одна имела четыре положительных по сальмонеллам пула из шести. Из 10-ти ферм, инфицированных ранее, только на одной был обнаружен один пул с положительным результатом по сальмонеллезу из шести.

Маловероятно, чтобы столь небольшое количество положительных случаев было результатом низкой степени инфицированности клещей, поскольку ранее мы продемострировали, что сальмонеллы могут размножаться в организме клещей, а треть искусственно инфицированных особей содержит более 2х104 КОЕ сальмонелл через 14 дней (Valiente Moro et al. , 2007a). Мы допускаем, что на инфицированных птицефермах некоторые особи клещей содержат то же количество сальмонелл после размножения бактерий.

В данном предварительном исследовании была проведена оценка применения этой методики на птицефермах. Кроме того, несмотря на ограниченное количество образцов, мы продемонстрировали, что куриный клещ D. gallinae может быть инфицирован естественным образом в условиях контаминированных хозяйств.

Другим интересным результатом стал тот факт, что сальмонеллы были обнаружены у клещей, собранных на птицеферме, на которой в настоящий момент инфекция не была зафиксирована. Это позволяет предположить, что клещи, инфицированные во время последней вспышки инфекции, пережили периоды санитарной обработки, а также программы очистки и дезинфекции и могут стать источником инфекции для новых особей кур. Таким образом, Dermanyssus gallinae может выполнять функцию активного резервуара инфекции и, безусловно, играть роль в эпидемиологии птичьего сальмонеллеза, как ранее было продемонстрировано Zeman et al. (1982).

В настоящее время существуют методики оценки роли D. gallinae в распространении птичьего сальмонеллеза. Кроме того, данное предварительное исследование демонстрирует, что в дикой природе этот клещ может быть носителем указанных патогенных бактерий и обеспечивать их выживание в период между вспышками инфекции. Чтобы точно оценить распространенность клещей-носителей сальмонелл на птицефермах, в будущем необходимо провести национальное исследование в сотрудничестве с DSV во Франции.

Благодарности

С. Валиенте Моро и С. Деслоире внесли огромный вклад в настоящую работу. Мы благодарим Куог Данг Куок за техническую поддержку. Мы также благодарим Центральнцю исследовательскую лабораторию птицеводства и свиноводства AFSSA (Французкое агентство по санитарной безопасности пищевых продуктов), Плуфраган (Франция) за предоставленный штамм сальмонелл и Джеральда Ландрира, сотрудника организации ITAVI (Технический институт птицеводства), а также ветеринарных специалистов, работающих в птицеводстве, за сбор образов популяции клещей на инфицированных птицефермах.

Ссылки

Baumler , A.J. , Heffron , F. & Reissbrodt , R . ( 1997 ) Rapid detection of Salmonella enterica with primers specific to iroB . Journal of Clinical Microbiology , 35 , 1224 – 1230 .

Bruneau , A. , Dernburg , A. , Chauve , C. & Zenner , L . ( 2001 ) First in vitro cycle of the chicken mite, Dermanyssus gallinae (De Geer, 1778), utilizing an artificial feeding device . Parasitology , 123 , 583 – 589 .

Chauve , C . ( 1998 ) The poultry red mite D ermanyssus gallinae : current situation and future prospects . Veterinary Parasitology , 8 , 364 – 376 .

Davies , R.H. & Breslin , M . ( 2003 ) Persistence of Salmonella Enteritidis Phage Type 4 in the environment and arthropod vectors on an empty free-range chicken farm . Environmental Microbiology , 5 , 79 – 84 .

Desloire , S. , Valiente Moro , C. , Chauve , C. & Zenner , L . ( 2006 ) Comparison of four methods of extracting DNA from D. gallinae (Acari: Dermanyssidae) . Veterinary Research , 37 , 725 – 732 .

Higgins , J.A. , Hubalek , Z. , Halouzka , J. , Elkins , K.L. , Sjostedt , A. , Shipley , A.M. & Ibrahim , M.S . ( 2000 ) Detection of Francisella tularensis in infected mammals and vectors using a probe-based polymerase chain reaction . American Journal of Tropical Medicine and Hygiene , 62 , 310 – 318 .

Kwang , J. , Littledike , E.T. & Keen , J.E . ( 1996 ) Use of polymerase chain reaction for salmonella detection . Letters in Applied Microbiology , 22 , 46 – 51 .

Lacey , R.W . ( 1993 ) Food-borne bacterial infections . P arasitology , 1 07 ( Suppl ), 75 – 93 .

Lampel , K.A. , Orlandi , P.A. & Kornegay , L . ( 2000 ) Improved template preparation for PCR-based assays for detection of food-borne bacterial pathogens . Applied and Environmental Microbiology , 66 , 4539 – 4542 .

Lin , C. & Tsen , H . ( 1996 ) Use of two 16S DNA targeted oligonucleotides as PCR primers for the specific detection of Salmonella in foods . Journal of Applied Bacteriology , 80 , 659 – 666 .

Peter , T.F. , Deem , S.L. , Barbet , A.F. , Norval , R.A. , Simbi , B.H. , Kelly , P.J. & Mahan , S.M . ( 1995 ) Development and evaluation of PCR assay for detection of low levels of Cowdria ruminantium infection in Amblyomma ticks not detected by DNA probe . Journal of Clinical Microbiology , 33 , 166 – 172 .

Schwartz , I. , Varde , S. , Nadelman , S.R.B. , Wormser , G.P. & Fish , D . ( 1997 ) Inhibition of efficient polymerase chain reaction amplification of Borrelia burgdorferi DNA in blood-fed ticks . American Journal of Tropical Medicine and Hygiene , 56 , 339 – 342 .

Snowden , K.F. , Logan , K.S. & Vinson , S.B . ( 2002 ) Simple, filterbased PCR detection of Thelohania solenopsae (Microspora) in fire ants ( Solenopsis invicta ) . Journal of Eukaryotic Microbiology , 49 , 447 – 448 .

Valiente Moro , C. , Chauve , C. & Zenner , L . ( 2005 ) Vectorial role of some dermanyssoid mites, (Acari, Mesostigmata, Dermanyssoidea) . Parasite , 12 , 99 – 109 .

Valiente Moro , C. , Chauve , C. & Zenner , L . ( 2007a ) Experimental infection of Salmonella Enteritidis by the Poultry Red Mite , Dermanyssus gallinae. Veterinary Parasitology , 146 , 329 – 336 .

Valiente Moro , C. , Fravalo , P. , Amelot , C. , Chauve , C. , Salvat , G. & Zenner , L . ( 2007b ) Colonization and organ invasion in chicks experimentally infected with Dermanyssus gallinae conta minated by Salmonella Enteritidis . Avian Pathology , in press .

Zeman , P. , Stika , V. , Shalka , V.B. , Bartik , M. , Dusbabeck , F. & Lavickova , M . ( 1982 ) Potential role of Dermanyssus gallinae (De Geer 1778) in the circulation of the agent of pullurosis-typhus in hens . Folia Parasitologica, 29 , 371 – 374 .

Ziemer , C.J. & Steadham , S . ( 2003 ) Evaluation of the specificity of Salmonella PCR primers using various intestinal bacterial species .Letters in Applied Microbiology , 37 , 463 – 469 .

Принято 10 апреля 2007 года